牛肉是世界上消费最广泛的肉类之一，牛肉质量决定消费者购买决策。屠宰后肌肉组织细胞开始经历多种形式的死亡，如坏死、凋亡、焦亡和自噬，这是肌肉转化为肉的第一步，这一过程引发了一系列复杂的生化反应。铁死亡是最近在冷藏牛肉中发现的一种细胞死亡过程，其介导的蛋白质氧化和细胞死亡可能会降低肌肉质量，但其机制尚不清楚。

2023年9月26日，宁夏大学刘敦华教授团队在Food Chemistry（IF=8.8）上发表题为“TMT quantitative proteomics analysis reveals molecular mechanism of ferroptosis during beef refrigeration”的研究文章。研究人员利用TMT定量蛋白质组学共鉴定出377个差异表达蛋白(DEPs)。转铁蛋白、铁蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) 4和血红素加氧酶1等15种DEPs参与脂质过氧化、Fe2+ 和Fe3+ 转化、铁离子积累和线粒体氧化应激诱导铁死亡。此外，化学致癌物ROS、谷胱甘肽代谢、HIF-1和PPAR等信号通路可能通过影响游离铁过载和GPX4失活来促进铁凋亡。该研究成果中 拜谱生物 为其提供 TMT蛋白组学 的检测与分析，发现的差异蛋白有助于拓展屠宰后牛肉储存过程中铁死亡的生理和分子机制的认识。

文章名称：TMT quantitative proteomics analysis reveals molecular mechanism of ferroptosis during beef refrigeration（FOOD CHEM.，IF=8.8，2023.09）

客户单位：宁夏大学

研究材料：牛肉

分组信息：不同冷藏时间的成品肌肉组织

拜谱提供技术：TMT蛋白质组学

PART 01

研究结果

研究人员探究随着冷藏时间延长牛肉的硬度、持水力、色泽、游离铁含量、ROS、脂质过氧化物、MDA、GSH和GPX4水平来评估肌肉组织细胞的铁死亡状态。结果显示，冷藏时间延长后，牛肉的硬度在第4天和第6天显著下降；持水能力降低；颜色变深，失去光泽，鲜红色变为暗红色。此外，游离铁、活性氧和MDA的含量显著增加，细胞凋亡率显著升高。

研究人员提取不同冷藏时间的肌肉样品的蛋白质，然后进行SDS-PAGE分析，蛋白质条带在不同时期分布均匀且相似（图1a）。根据蛋白在不同样品中的表达情况，分析发现同一组样品的中位数接近于同一水平（图1b），说明肌肉样品蛋白质具有良好的组内相似性和组间差异性。

蛋白质组学共鉴定出1996种蛋白质。以B0为对照组，筛选B1、B2、B4和B6中的蛋白进行差异表达分析，共鉴定到377个DEPs。将火山图可视化，并根据FC > 1.2、FC < 0.86和P < 0.05两个标准分析DEP。结果如图1c-f所示，在B1/B0、B2/B0、B4/ B0和B6/B0中分别鉴定出22、33、73和140个DEPs，其中分别上调6、11、32和88个，下调16、22、41和52个。聚类方法评估了不同冷藏阶段肌肉组织中蛋白质的表达，结果显示肌肉蛋白表达差异随着储存时间的增加而增加（图1g）。

图1| 不同冷藏时间的肌肉样品蛋白质组学(图源：Jun Liu, et al., FOOD CHEM., 2023)

随后研究人员对差异蛋白进行生物信息学分析，GO术语分为生物过程（BP）、分子功能(MF)和细胞成分(CC)。如图2所示，BP组的DEPs主要参与细胞过程(148)、代谢过程(116)、生物调节(78)、生物过程调节(74)和对刺激的反应(57)。MF组的DEPs主要参与结合(114)、催化活性(75)等。CC组的DEPs主要涉及细胞解剖实体(171)和含蛋白复合物(56)等。为了在分子水平上阐明DEPs在细胞和生物体中的功能和通路，研究人员将DEPs富集的KEGG通路进行注释和鉴定。图2b显示了前20个富集通路，包括铁死亡、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、神经变性-多发性疾病通路、碳代谢、柠檬酸循环(TCA循环)和氧化磷酸化。其中，参与铁死亡途径的DEPs有15个。

为了进一步探索与铁死亡相关的通路相互作用，对鉴定的15个DEPs进行了KEGG通路分析。参与铁死亡的前20条相关途径（图2c）主要包括细胞过程、环境信息处理、代谢和机体系统。铁死亡是细胞衰老和坏死的重要过程。其中38个差异表达的蛋白参与了总共38条途径（图2d）。蛋白相互作用分析表明，除VDAC3和PRNP外，所有蛋白相互作用调节铁死亡（图2e）。对已鉴定的与铁下垂有关的DEPs进行亚细胞定位分析，发现与铁死亡有关的代谢过程主要发生在细胞质、内质网、线粒体、膜、高尔基体和细胞外区（图2f和g）。

图2| 不同冷藏时间的肌肉样品差异蛋白分析(图源：Jun Liu, et al., FOOD CHEM., 2023)

研究人员根据TMT定量蛋白质组学分析结果，选择15个参与铁死亡调控的蛋白进行PRM定量验证。如表1所示，每个蛋白至少含有1个唯一性肽段，由于蛋白的同一性和丰度要求，通过PRM用目标肽片段的定量数据进行验证。结果发现与TMT定量蛋白测定相同，参与铁死亡途径的15种蛋白的离子丰度变化趋势相同，有8种DEPs上调，7种DEPs下调。

表1 铁死亡蛋白肽的PRM定量分析(表源：Jun Liu, et al., FOOD CHEM., 2023)

总的来说，铁蛋白水平的下调（图3）表明它在制冷过程中被降解了。HMOX1的上调表明在冷藏过程中发生了血红素降解。PCBP2水平的降低抑制了FPN介导的 Fe2+易位过程。此外，转移到细胞外腔室的 Fe2+在铜蓝藻的作用下迅速转化为 Fe3+，与转铁蛋白结合的 Fe3+通过TBITFR1复合物转移到细胞内腔室，可能导致细胞内PCBP1/2水平的降低。PCBP1和PCBP2蛋白表达水平降低，表明与 Fe2+大分子的结合过程减弱，这也促进了 Fe2 +在细胞内的积累。GSH水平下调表明GPX4功能下降，可能导致铁死亡过程增强，同时ROS水平显著升高，ROS水平升高提示肌肉组织抗氧化能力下降，肌肉组织氧化增强。CSL4和LPCAT3蛋白水平升高，表明AA途径被激活，脂质过氧化产物丙二醛水平升高。脂质是肌肉的重要组成部分，也是肌肉系统中化学性质最不稳定的成分之一，铁死亡途径通过细胞膜氧化诱导细胞死亡。

图3| 基于KEGG富集差异表达蛋白的铁死亡机制(图源：Jun Liu, et al., FOOD CHEM., 202

PART 02、拜谱小结

作者利用TMT定量蛋白质组学鉴定发现15个参与铁死亡调节的DEPs，包含铁离子运输、 Fe2+ 和 Fe3+转化、脂质氧化途径、氧化还原调节和含铁蛋白降解途径。铁死亡依赖于铁离子积累、GPX4失活和脂质过氧化。此外，通过对DEPs的蛋白质和途径相互作用分析，发现了37条代谢途径，通过调节细胞铁超载、细胞膜或细胞器膜脂质氧化和ROS积累来促进铁死亡。铁下垂机制的发现可能为提高牛肉冷藏品质的相关研究提供新的视角，可能有助于预测肉类的潜在质量和鉴定铁下垂的生物标志物。这一过程中拜谱生物提供了TMT定量蛋白质组学技术服务，拜谱生物已研发完成并建立了完善成熟的转录组学、蛋白组学、代谢组学以及多组学联合产品技术服务体系，欢迎致电咨询！

参考文献：Liu J, Liu D, Hu Z, Hu Y, Yu X. TMT quantitative proteomics analysis reveals molecular mechanism of ferroptosis during beef refrigeration. Food Chem. 2023 Sep 26. doi: 10.1016/j.foodchem.2023.137596.