单细胞测序对样本的要求确实很高，冻存样本、难解离组织、细胞活率低……这些情况都可能让人感到棘手，甚至怀疑实验是否还能继续。但实际上，这些问题并非无解。

单细胞数据的质量，从样本离开生物体的那一刻起就决定了。如果样本类型选错，或者处理方法不当，即使后续使用再先进的测序平台，也很难挽回。不过，别担心，拜谱生物能够为您提供从样本处理到数据分析的单细胞全流程服务。今天，我们就来聊聊如何根据你的实验目标和样本特性，为单细胞测序样本制备“量体裁衣”，避开那些可能让数据翻车的坑，帮您稳稳拿下高质量单细胞数据。

1、核心策略：实验设计决定样本制备「最优解」

细胞悬液 VS 细胞核悬液：选对等于成功一半

是研究免疫细胞动态还是神经元的表观调控？

获得的是新鲜手术样本还是冻存多年的珍贵组织？

①新鲜组织 & 关注免疫组(如TCR/BCR)：

■首选细胞悬液，能保留完整细胞结构和膜蛋白，是研究免疫组库、细胞异质性和动态变化的理想选择。

■关键点：动作要快，解离后尽快上机，保持高细胞活性(≥90%)。尤其做VDJ富集，样本中T/B细胞占比最好>20%，否则需考虑分选富集。

拜谱小贴士： 肿瘤免疫微环境研究？强烈推荐新鲜组织制备细胞悬液上机，信息更全面。

②冷冻样本&难处理组织 (如脑、脂肪、心脏、肝)：

■解锁方案：冷冻会破坏细胞膜，mRNA易降解泄漏，背景噪音高。提取细胞核能有效规避此问题，且细胞核更耐冻存，方便运输和批量处理。

■关键点：适用于snRNA-seq研究核转录组，或与scATAC-seq整合进行表观调控研究。对细胞直径大(>40μm)、形状不规则(如神经元、心肌细胞)或脆弱不易获得的细胞(如肝实质细胞)特别友好。

拜谱小贴士：神经系统研究、回顾性样本分析？冻存组织提核是我们的常用且可靠方案。

③ 简单总结：

■想做免疫组库 (scTCR/BCR)？→选择新鲜细胞悬液。

■样本已经冻存or特殊样本难解离？→细胞核悬液拯救样本。

■转录组 (scRNA-seq)？→细胞or核两者通常结果相似，根据样本状态灵活选择。

2、避坑指南：高质量单细胞样本的“黄金标准”

在实验方案明确的基础上，样本悬液的制备质量也同样重要，为确保单细胞测序数据的可靠性，也请关注以下的关键质控指标：

①活率是生命线：≥90%，台盼蓝染色+ Countess II计数，台盼蓝染色只是基础，复杂样本改用AO/PI荧光双染。【活率不够解决方案，如死细胞去除试剂盒（样本量达百万细胞数，90%≥活率≥70%可考虑使用去死细胞试剂盒解救）、特定细胞分选富集（CD45磁珠富集免疫细胞）等个性化方案，助你达标。】

②状态要“清爽”：无/极少红细胞、碎片少(比率≤10%)、结团少(比率≤10%)、稳定性好(30分钟活率波动<±5%)、有核率高(>70%)。【切记：悬液中不能有反转录抑制剂(如过量EDTA)或钙镁离子(Ca2+, Mg2+)。】

③数量要充足：总量≥100万细胞，实体样本采集量≥0.2g新鲜组织；（参考⻩⾖粒：0.5cm2⼤⼩）组织较⼤时，可分割为多颗粒（每颗粒≤ 0.5cm2⼤⼩）。样本运输、质检、实验损耗都需要考虑，充足的细胞是成功的保障。特殊情况也需保证至少是预期捕获细胞数的3倍以上。

④浓度要适宜：700-1200个/µl最佳，太多或太少都会影响仪器捕获效率。

⑤ 细胞/核大小形态：直径在7-35µm之间，细胞核尽量圆润完整。

拜谱小贴士： 担心细胞捕获数不理想？除了以上因素，细胞大小差异、空液滴干扰等也会影响。我们通过优化上样和严格质控，力求将捕获数稳定在3000-8000个高质量细胞/样本的黄金区间。

3、实战秘籍：不同样本，这样处理才靠谱！

由于不同组织具有独特的生物学特性，其解离方案需针对性优化，以最大限度保持细胞活性和回收率。根据不同样本类型可参考以下的处理建议：

①新鲜实体组织 (如肿瘤、肝、脑)：

核心挑战：快速解离+保护活性。

■解离有讲究：乳腺癌的胶原纤维用Liberase TM效果好，胶质瘤的胞外基质可能需木瓜蛋白酶。拜谱生物根据组织类型定制酶解方案，并加入DNase I降低粘度，添加RNasin抑制剂保护RNA。

■操作要温柔：宽口吸头、轻柔吹打，保持细胞膜完整、严格无菌，避免污染和杂质干扰。

■黄金时间窗：离体后尽快(最好2小时内)置于保护液并处理。

②血液/骨髓样本：

■ 防凝是前提：首选紫色EDTA抗凝管，取4mL以上样本量，取样后充分颠倒混匀。

■去红是常态：ACK裂解液或Ficoll密度梯度离心去除红细胞。

■富集有需要：寻找稀有细胞，推荐使用磁珠标记分选。

客户实战案例及拜谱解决方案：

案例1：小鼠脾脏样本

错误操作：直接冻存后提核

结果：TCR序列完全丢失（免疫研究失败）

正确做法：新鲜制备细胞悬液，2小时内上机

案例2：人类脂肪组织

错误操作：机械解离+70μm过滤

结果：细胞捕获数不足2000个（脂肪细胞堵塞芯片）

正确做法：重新准备样本，抽提细胞核重新实验

4、稳赢最后一步：样本保存与运输的“安全法则”

每一份珍贵的样本都承载着科研的希望与价值，为确保细胞的活性与细胞完整性，提供精准适宜的样本保存与运输条件也尤为重要：

① 样本保存：

新鲜组织：浸没在足量组织保存液中(可联系我司提供)，4℃冰浴(切忌结冰)。

冷冻组织：液氮速冻，避免反复冻融。

血液：EDTA抗凝管采集，轻柔混匀10次。4℃保存。

② 样本运输：

■ 同城：

新鲜样本/血液：湿冰完全覆盖样本管，泡沫箱/S60保温箱，密封好。

冷冻样本：干冰完全掩埋样本(冻存管密封防RNase)。

■异地：

新鲜样本/血液：冷链运输(4℃，加预冷冰袋)，尽快送达，超过48小时可能会影响细胞状态，密封+充足冰量。

冷冻样本：足量干冰运输(按天数+距离增加干冰量，通常+1天需+5kg)。

拜谱小贴士： 提前预约实验室排期，清晰标注样本信息(类型、名称、分组)，填写好送样表，并告知物流信息给对接技术员，流程更顺畅。

拜谱小结

单细胞测序打开了探索生命微观奥秘的大门，但样本制备的复杂性和高要求，往往让科研人员望而生畏，甚至成为数据质量的瓶颈。拜谱生物深耕时空多组学多年，深谙单细胞样本制备的每一个关键点。我们致力于为您扫清障碍，让样本准备变得轻松，让高质量数据触手可及。与其在样本准备上耗费大量精力并承担失败风险，不如将专业的事交给专业的人。还在为单细胞样本发愁？立即联系拜谱生物科研顾问。获取专属样本处理建议，咨询单细胞测序全流程服务，解锁蛋白组、修饰蛋白组、代谢组、转录组、基因组等多组学整合方案。