肠道是一个复杂的器官，里面充满了多种微生物。随着年龄的增长，肠道经历氧化应激的可能性往往会增加。导致肠道氧化应激的自由基有多种来源，包括正常的细胞代谢、炎症过程、饮食因素、环境暴露和肠道菌群。与衰老相关的氧化应激加上抗氧化防御系统的功能下降可能对肠道屏障、肠道菌群和免疫功能产生不利影响。

蛋白质半胱氨酸（Cys）修饰，例如S-次磺酸化（SOH）、S-亚磺酸化（SO2H）、S-磺酸化（SO3H）、S-谷胱甘肽化（SSG）、S-亚硝基化（SNO）和二硫键（S-S）等与氧化应激密切相关，并在细胞内形成动态调节网络。这些翻译后修饰（PTM）以及Cys残基的还原态（游离SH）共同维持细胞和器官的整体氧化还原平衡。Cys氧化还原修饰的失衡不仅是氧化应激的指标，还可能促进肠道内的氧化损伤，与肠道衰老和疾病发生相关。然而当前仍然缺乏对Cys修饰的景观、化学计量及其在肠道衰老过程中功能的系统探索。此外，氧化应激和Cys修饰的内源性调节因子在很大程度上仍然未知。

2025年1月8日，四川大学华西医院戴伦治团队在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF 40.8）上发表题目为“Low-input redoxomics facilitates global identification of metabolic regulators of oxidative stress in the gut”的文章，作者建立了一种高效、低样本量的全局氧化还原修饰组学（redoxomics）技术流程，可以同时表征5种Cys氧化还原状态。研究人员应用此策略，以猴子、小鼠肠道组织为对象研究了与衰老相关的Cys氧化还原修饰谱，通过多组学整合分析揭示了肠道氧化应激信号代谢调控机制。

研究结果

01全局Cys氧化还原修饰组的技术流程

为了获得更全面的Cys氧化还原状态，作者采取不同的前处理方法分别对不同的Cys修饰或游离SH进行还原、生物素标记、酶解，然后再利用串联质量标签（TMT）标记进行区分不同处理的样本即不同的修饰类型，肽段混合后进行质谱检测（图1）。此外，每个TMT批次中都包含一个通用参考样本，作为数据标准化的参照。作者利用该方法定量检测了猕猴结肠组织中Cys氧化还原修饰谱，共获得14,751个游离SH位点、14,794个总氧化修饰位点（Sto）、9,620个SOH位点、4,094个SNO位点和13,456个SSG位点。

图1 高通量Cys氧化还原修饰组学分析的技术流程，覆盖了游离自由基SH、SOH、SSG、SNO和总氧化（Sto）5种氧化修饰状态

（图源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

02衰老过程Cys氧化还原修饰化学计量特征

研究人员比较了幼年、中年、老年猕猴升结肠和降结肠组织氧化修饰蛋白谱，发现与肠道衰老相关的Cys修饰状态。作者利用某个Cys位点上某种修饰占该位点总氧化修饰（Sto）和游离SH总和的相对含量来衡量该修饰的化学计量，即占有率。利用样本中所有Cys修饰占有率的中位值来衡量该类型修饰的平均水平。研究发现老年升结肠和降结肠中SOH、SSG和SNO的平均水平显着增加，其中SSG的化学计量显著高于SOH和SNO，说明SSG修饰可能与肠道衰老更密切相关（图2）。差异修饰位点所属蛋白质的通路富集分析揭示了SOH和SSG修饰的蛋白质参与细胞粘附和蛋白质折叠，而SNO修饰的蛋白质可能在免疫调节中发挥关键作用（注：差异修饰位点的筛选是依据肽段强度而非占有率，通过ANOVA差异检验）。研究结果还揭示了与肠道衰老相关的位置特异性Cys氧化还原调节，SSG修饰蛋白在降结肠的细胞-细胞粘附途径中富集，但在升结肠中未富集。总体而言，研究提出了与非人灵长类动物肠道衰老相关的SOH、SSG和SNO修饰的特征和化学计量。

图2 SSG、SOH、SNO三种Cys修饰占有率在不同年龄组中的密度图分布

（图源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

03Cys总氧化占有率的年龄相关变化

同样作者利用Sto的占有率来评估不同分组间的Cys总体氧化水平，发现Sto的占有率呈现两个峰值，随着年龄的增长，这两个峰值也会增加，表明老年组中Cys总体氧化水平更高。并对那些随着年龄变化Sto占有率大幅增加或降低的Cys位点以及那些与年龄相关的差异Sto肽段所属的蛋白质进行功能富集分析，进一步描绘了衰老相关的Cys氧化状态的改变及其对细胞生物学过程和功能的效应（图3a-d）。

作者进一步探究了氧化修饰是否赋予蛋白质新的功能。将与年龄相关的Cys的Sto修饰位点与转录组、蛋白质组和代谢物组数据集进行相关性分析，对相关性高的top50个Cys位点取交集获得28个常见Cys位点（图3e）。（注：两组学数据的Spearman相关性分析是挖掘关键分子的常用方法，背后的逻辑是不同层次的组学往往是互相关联的。Venn分析是进一步缩小筛选范围的常用策略。）通过在细胞水平对这些基因Cys突变为Ser，发现这些蛋白的非氧化状态或氧化状态在应对氧化应激方面发挥关键作用（图3f-h）。这表明Cys氧化不仅是氧化应激的结果，而且还赋予这些蛋白质新的功能，使它们能够对抗或促进氧化应激。

图3 与年龄相关的Cys氧化位点及其功能分析

（图源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

04氧化应激代谢调控因子的探究

越来越多的证据表明氧化应激代谢调节的重要性。糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化等代谢途径会产生ROS副产物。代谢稳态的破坏，例如过量的热量摄入和营养失衡，会加剧氧化应激。作者探究了代谢物与Cys氧化还原修饰相互作用在肠道衰老中的分子机制。通过对年龄相关的Cys修饰位点与不同年龄结肠代谢组数据进行相关性分析，发现了与Sto水平正相关和负相关的代谢物（图4a-c）。（注：文章反复利用相关性分析挖掘两组组学数据的关键分子）通过在细胞实验中添加筛选的代谢物，发现Sto负相关代谢物能抑制ROS的产生，Sto正相关代谢物能促进ROS的产生（图4d）。（注：代谢组学常用的验证方法，直接小分子处理或者基因突变小分子代谢酶。）

为了进一步探索这些代谢物对氧化应激的影响，作者在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中利用Cys氧化修饰组学和蛋白质组学评估了代谢物富马酸对抗氧化应激的能力。富马酸处理下调了数百个Cys残基的氧化水平，升结肠和降结肠的Sto化学计量几乎恢复到同一水平，表明富马酸抑制DSS诱导的氧化应激。蛋白质组学分析进一步揭示富马酸显著抑制免疫和炎症反应过程，促进线粒体呼吸的蛋白质表达，减轻ROS的产生。研究阐明了氧化还原修饰组和代谢组之间的全面交互，并确定了许多关键的代谢物，这些代谢物是肠道氧化应激的内源性调节因子。（注：作者在灵长类动物中发现了代谢物与Cys修饰的交互作用，然后又在细胞和小鼠中验证代谢物的功能，同时用修饰组和蛋白质组研究代谢物的作用机制，把代谢物→蛋白质（修饰）→抗氧化应激表型的逻辑关系阐述清楚了。）

图4 衰老过程氧化应激的代谢调控

（图源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

05热量限制（CR）饮食干预对肠道氧化还原信号的影响

CR是指在没有营养不良的情况下有意识地减少卡路里摄入量，研究表明CR可减少 ROS的产生和氧化应激，从而可能延长寿命。作者在小鼠模型中探究了CR对肠道代谢和Cys氧化还原修饰组的影响。CR干预后差异表达的Cys肽段数量减少，Sto占有率降低。通路富集分析显示CR干预后升结肠和降结肠中参与细胞粘附的蛋白质Sto水平均降低。与细胞生长相关途径相关的蛋白质如细胞周期、葡萄糖代谢和细胞分裂，也表现出Sto水平降低。代谢组学表明CR处理可以上调那些抗氧化的代谢物产生，如尿囊素、N-乙酰丙氨酸、富马酸、吲哚乳酸和硫酸普拉酮等。

小结

综上，本研究改进了Cys氧化还原修饰组的分析方法，提高了效率和准确性，同时减少了样品投入和成本。另外，研究确定了各种Cys氧化还原修饰的化学计量，并分析了它们在肠道衰老过程中的动力学。本研究利用多组学分析策略，鉴定了许多氧化应激关键内源性调节因子。研究还发现CR 重新编程细胞代谢和Cys氧化还原修饰水平，可能影响肠道氧化应激和肠道衰老（图5）。

图5 多组学分析氧化修饰调节肠道衰老的技术路线

（图源：Xiao et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025）

拜谱小结

ROS会在Cys和蛋白质骨架内产生各种可逆的修饰。这些氧化翻译后修饰可以参与信号转导途径的激活并调节细胞功能。大量研究表明蛋白质的氧化修饰与衰老、癌症、糖尿病、神经退行性疾病的病理机制有关，而且还在植物生长发育、新陈代谢、抗逆等的调控中扮演着重要角色。Cys修饰蛋白质组学能全面的捕获不同处理组间Cys氧化水平的变化，为研究氧化应激参与疾病或发育的调控机制提供帮助。Cys修饰组和蛋白质组、代谢组的多组学整合分析成为深入挖掘氧化应激分子机制的研究利器。

这么多修饰类型，该怎么选呢？小编这里有几点建议，供参考：

（1）看修饰酶的表达变化，比如棕榈酰化修饰酶ZDHHC、亚硝基化修饰酶NOS、谷胱甘肽去修饰酶Grx1等；

（2）看底物的变化，比如棕榈酸化底物棕榈酰-CoA、亚硝基化底物NO、谷胱甘肽化影响因素GSH/GSSH比值、硫巯基化底物H2S、次磺酸化底物ROS等；

（3）如果没有特定的影响因素，我们可以选择total氧化还原修饰，无差别检测Cys所有修饰。

拜谱生物作为国内领先的多组学技术服务公司，在氧化还原修饰蛋白质组学领域深耕多年，是国内首家开展棕榈酰化修饰蛋白质组服务的公司，现已推出了半胱氨酸7大修饰产品，包括棕榈酰化、亚硝基化、谷胱甘肽化、硫巯基化、次磺酸化、total氧化还原和游离巯基，并助力发表了一系列高水平文章，包括Nature、Molecular Cancer等。此外，拜谱生物新开发的Cys-Tag标记方法，现已实现半胱氨酸氧化还原修饰的全局检测，一次检测可对多种修饰同时表征。欢迎咨询！

参考文献：

Xiao, X., Hu, M., Gao, L. et al. Low-input redoxomics facilitates global identification of metabolic regulators of oxidative stress in the gut. Sig Transduct Target Ther 10, 8 (2025). https://doi.org/10.1038/s41392-024-02094-7B1