锌是人体内重要的微量元素之一，对生物体的正常生理功能至关重要，参与多种生物过程，包括酶的活性、DNA和RNA的合成、免疫系统的功能以及细胞信号传导。锌在细胞内主要以离子的形式存在，与多种蛋白质结合，影响其结构和功能。锌结合蛋白质广泛存在于各种生物体中，具有多重功能，包括催化化学反应、稳定蛋白质结构、参与信号传导，以及负责锌离子的运输和储存。然而，科学家们对于锌如何与蛋白质相互作用，以及这些相互作用在维持细胞功能和预防疾病中的作用了解甚少。

2024年12月26日美国丹娜法伯癌症研究院在Cell杂志（IF：45.5）上发表了题为“The human zinc-binding cysteine proteome”的研究文章，本研究基于半胱氨酸定量蛋白组学，获得了人类锌结合半胱氨酸谱（ZnCPT），量化了人类蛋白质组中超过58,000个半胱氨酸位点与锌的结合状态，使得系统地发现锌调节的结构、酶和别构功能域成为可能。还确定了52个受锌结合的癌症遗传依赖性，并提名了对锌诱导细胞毒性敏感的恶性肿瘤。并且发现了一种锌调节谷胱甘肽还原酶（GSR）的机制，该机制驱动GSR依赖性肺癌细胞和体内肿瘤的细胞死亡。总而言之，ZnCPT是一个宝贵的资源，可以帮助我们深入了解锌在细胞功能中的作用，并为开发新的癌症治疗方法提供了新的途径。

模式图

图1 模式图（图源：Burger, et al., Cell, 2024）

开发定量分析锌结合半胱氨酸的方法

为了深入理解锌在蛋白质中的作用，研究人员开发了一种用于定量分析人类蛋白质组中与锌结合的半胱氨酸的方法，结合了半胱氨酸活性磷酸盐标签（CPT）和串联质谱标签（TMT）的蛋白质组学技术，并在HCT116细胞、人肝细胞和人前列腺上皮细胞中进行了实验。通过CPT标记和富集技术，研究者评估了半胱氨酸的可用性，并使用TPEN、EDTA和ZnCl2处理细胞裂解物，以确定构成型和诱导型锌结合半胱氨酸，共分析了超过58,000个半胱氨酸位点，其中大多数位点之前未被实验评估过，揭示了锌结合蛋白质组具有多种特征，包括不同的亚细胞定位和蛋白质功能。这一方法显著提高了半胱氨酸肽富集，使研究锌结合蛋白成为可能。

图2 ZnCPT数据集提供了锌结合蛋白质组的定量图（图源：Burger, et al., Cell, 2024）

接下来，研究人员利用质谱技术定量分析了不同处理条件下半胱氨酸的标记水平，识别出4,830个构成型锌结合半胱氨酸、6,419个构成型金属结合半胱氨酸和1,742个诱导结合锌的半胱氨酸。构成型锌结合蛋白主要富集于核蛋白，而诱导型锌结合蛋白则主要富集于囊泡蛋白、内体/溶酶体系统蛋白和内质网蛋白。

为了图3 锌和金属结合半胱氨酸蛋白质组（HCT116裂解物）的表征

（图源：Burger, et al., Cell, 2024）验证ZnCPT方法在识别已知锌结合蛋白方面的有效性，研究人员将ZnCPT数据与锌结合蛋白数据库（ZincBind）以及基于生物信息学和序列分析的预测数据集进行了比较。ZnCPT成功识别了850多个已知的锌结合蛋白，包括构成型和诱导型锌结合位点。与ZincBind数据库相比，ZnCPT的覆盖范围更广，并识别了更多的锌结合位点。这一结果表明，ZnCPT方法能够有效地识别和定量分析人类蛋白质组中的锌结合位点，为锌结合蛋白质组学的研究提供了有力工具。

图4 ZnCPT准确地报告了锌/金属结合的实例（HCT116裂解物）

（图源：Burger, et al., Cell, 2024）

分析锌结合蛋白质组的特征

研究人员还探索了锌结合位点在结构和序列上的特征，以深入了解锌如何与蛋白质相互作用。他们采用了Pfam域注释和序列分析来识别锌结合位点的结构特征，并利用AlphaFold结构预测来分析锌结合位点的三维结构，成功识别了不同的结构类别，包括构成型和诱导型锌结合位点，以及与锌结合相关的序列特征。构成型锌结合位点通常富含半胱氨酸和组氨酸，而诱导型锌结合位点则富含赖氨酸和酸性氨基酸。这些发现揭示了锌结合位点具有独特的结构和序列特征，这些特征可能有助于它们与锌配位，从而在细胞功能中发挥关键作用。

发现新的锌结合蛋白

为了扩展对锌在细胞功能中作用的理解，研究人员还致力于识别ZnCPT方法中发现的新的锌结合蛋白。他们利用AlphaFold结构预测来评估新发现的锌结合位点与已知锌结合蛋白的结构相似性。这些蛋白包括与已知锌结合蛋白同源的蛋白质和未知的蛋白质。例如， PTPC1中的一个新的锌结合位点，该位点与PTP1B中的锌结合位点结构相似。

图5 锌结合的序列和结构特征提名了以前未描述的锌结合蛋白

（图源：Burger, et al., Cell, 2024）

比较锌结合蛋白与氧化还原修饰蛋白

研究人员还比较了锌结合和氧化还原调节的半胱氨酸蛋白质组之间的重叠程度，以揭示这两种蛋白质修饰在细胞功能调控中的潜在差异。他们将ZnCPT数据与氧化还原调节的半胱氨酸数据集进行了比较，并评估了不同数据集中半胱氨酸的富集程度。结果显示，锌结合和氧化还原调节的半胱氨酸蛋白质组部分重叠，但两者之间也存在差异。氧化还原调节的半胱氨酸通常富含精氨酸，而锌结合位点则不含精氨酸。

比较锌与铁结合蛋白

此外，研究人员还探究了锌如何调节铁结合蛋白，以揭示锌在铁代谢和细胞内铁平衡中的潜在作用。他们分析了ZnCPT数据中与锌结合的铁结合蛋白，并验证了锌对这些蛋白的影响。发现锌可以调节铁结合蛋白，例如EGLN1和ISCU，并影响其功能。也可以抑制EGLN1的脯氨酸羟化酶活性，进而影响HIF1α的降解。这一发现表明锌在铁硫蛋白的生物合成和功能中起着重要作用。

图6 锌调节多种功能性蛋白类别，包括铁结合蛋白

（图源：Burger, et al., Cell, 2024）

研究锌对癌症依赖蛋白的影响

为了揭示锌在癌症发生和发展中的潜在作用，研究人员还确定了锌调节的癌症依赖蛋白的功能类别。他们将ZnCPT数据与癌症依赖性数据集（DepMap）进行了比较，并识别了锌结合的癌症依赖蛋白，评估了不同数据集中锌结合蛋白的富集程度，共识别了52个锌结合的癌症依赖蛋白，其中许多与癌症发生和发展相关。其中，GSR是一种参与维持细胞氧化还原平衡的酶，在肺癌细胞中高表达。这一发现表明锌在癌症发生和发展中起着重要作用，并且可能作为癌症治疗的新靶点。锌通过调节这些蛋白，可能影响癌症细胞的生长、增殖、代谢和凋亡。此外，锌对癌症依赖蛋白的调节也可能影响癌症细胞的免疫逃逸和化疗耐药性。

图7 作为癌细胞遗传依赖性的锌结合蛋白的系统鉴定

（图源：Burger, et al., Cell, 2024）

研究锌对GSR的影响

最后，研究人员探究了锌如何调节GSR并导致肺癌细胞死亡，以揭示锌在肺癌治疗中的潜在作用。他们验证了锌与GSR的结合，并使用酶活性测定技术和细胞毒性试验评估了锌对GSR依赖性肺癌细胞的影响。实验结果显示，锌可以抑制GSR的活性，并通过耗尽GSH导致肺癌细胞死亡。这说明GSR是肺癌细胞的一个潜在的锌调节靶点，锌可以通过抑制GSR来治疗肺癌，强调了锌在肺癌治疗中的潜在价值，并为开发新的肺癌治疗方法提供了科学依据。

图8 ZnCPT将GSR确定为可以受锌调节的癌症脆弱性

（图源：Burger, et al., Cell, 2024）

小结

总的来说，锌在蛋白质组中扮演着重要角色，特别是在调节细胞功能和疾病进程方面。通过开发和应用ZnCPT方法，研究人员能够更深入地理解锌与蛋白质的相互作用，为锌在生物医学领域的应用提供了新的视角和工具。

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参考文献：

Burger N, Mittenbühler MJ, Xiao H, Shin S, Wei SM, Henze EK, Schindler S, Mehravar S, Wood DM, Petrocelli JJ, Sun Y, Sprenger HG, Latorre-Muro P, Smythers AL, Bozi LHM, Darabedian N, Zhu Y, Seo HS, Dhe-Paganon S, Che J, Chouchani ET. The human zinc-binding cysteine proteome. Cell. 2024 Dec 26:S0092-8674(24)01341-2. doi: 10.1016/j.cell.2024.11.025