大脑的功能是高度多样化的，包括控制运动、处理感觉信息、学习和记忆形成等。为了完成这些复杂的任务，大脑呈现了一个解剖上不同但连接良好的高度复杂的脑区亚结构。人们花费了巨大的努力来解开大脑区域的分子差异，以及绘制它们的连接图。然而，目前缺乏全面的脑区蛋白质组学研究。

2023年11月，德国慕尼黑大学Bernhard Kuster团队在The EMBO journal期刊（IF=11.4）发表了一篇题为“A region-resolved proteomic map of the human brain enabled by high-throughput proteomics”的文章。本研究利用高通量人类FFPE脑蛋白质组学技术，通过分析涵盖 11,000 多种蛋白质的人脑13个区域共2000+FFPE脑组织样本，构成了迄今为止最全面的人类大脑蛋白质组图谱，系统评估并揭示了每个脑区独特的蛋白质组学特征。

一 、研究结果

01.FFPE人脑区域的深度蛋白质组学分析

样本：

13个脑区（伏隔核NA、黑质SN、橄榄OB、丘脑THL、红核NR、海马体HPC、壳核PUT、锁核CL、尾状核CN、小脑CBM+CBw和大脑皮层CC+CCw)。从每个脑区，收集3个组织块(~5 × 5 × 5 mm)并独立处理（OB区收集2个），共38个样本，之后蛋白质提取和消化。（图1）

图1|人类大脑的区域分辨蛋白质组图(图源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal.,

组织样本评估：

组织样本蛋白中位CV在10-20%之间。（图2）

图2|样本评估结果(图源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2023)

鉴定结果：

①：平均每个组织鉴定到9498个蛋白，所有脑区域共鉴定到11325个蛋白（图3E）。

②：比较新鲜冷冻样品和FFPE样品，发现蛋白质表达跨度约为6个数量级。FFPE中检测到的98.6%蛋白都包含在新鲜冷冻样本中，但整体强度较低。仅在新鲜冷冻组织中检测到的大多数蛋白质位于较低的丰度（图3F-G）。

这项研究通过高通量的蛋白质组学方法，为理解大脑不同区域的蛋白质表达提供了新的见解，并展示了高效蛋白质鉴定的技术进步。

图3|不同区域的脑蛋白分析(图源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2023

02.脑区分辨率的人类蛋白质组图谱分析

区域蛋白图谱特征：

13个大脑区域检测到共有蛋白占比64%，6%是单个区域特有的，主要存在于小脑CBM、大脑皮层CC、橄榄OB和海马体HPC区。（图4A）

区域特征蛋白分析：

根据人类蛋白质图谱（HPA）原则，定义了四类区域蛋白富集分类。1类蛋白（593）仅在1个大脑区域被检测到，2类（218）与所有其他区域相比，在1个大脑区域中至少表达四倍的蛋白质，第3类（77）在2-7个大脑区域中富集至少四倍），第4类（441）在1个区域中富集的蛋白质至少是所有其他区域平均值的四倍）。CBM区域表达的1、2和4类蛋白占比最高。相比之下，第3类蛋白在各个大脑区域之间分布更均匀，包括富集在PUT、CN和NAC区的蛋白质。这三个区域都是基底神经节的一部分。（图4B）

区域样本聚类分析：

tSNE分析以及分层聚类证实，解剖学上接近的大脑区域通常具有相似的蛋白质表达模式。如tSNE图中，基底神经节（NAC、CN、PUT）和中脑（NR、SN）区域的样本分别聚集在一起。（图4C）

蛋白组与转录组图谱分析：

有趣的是，在不同组织区域中，mRNA水平比蛋白质水平更稳定。这强调了直接测量蛋白质表达的重要性，特别是在识别某些大脑区域的标志物时，因为mRNA水平可能没有改变，但在蛋白水平发生了明显变化。（图4D）

区域标志物：

1类蛋白质最可能作为区域标志物，如小脑CBM区的MDGA1和SLC1A6以及橄榄OB区中的SBSPON和TPBGL。在大多数大脑区域中，发现了许多高丰度的区域标志物。（图4E-F）

图4|脑区域特异性蛋白表达模式(图源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 20

脑细胞类型特异性特征：

先前发表了对主要脑细胞类型（神经元N、小胶质细胞M、星形胶质细胞A和少突胶质细胞O）基于mRNA表达的细胞类型特异性特征，其中许多特征也在本研究的蛋白表达中被检测到。（图5A）

神经胶质细胞特征蛋白：

大约85%的基于神经胶质mRNA的特征蛋白在所有脑区都被检测到，并且数量相似，例如少突胶质细胞标志物MBP、星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物RGS10。其余15%在至少一个大脑区域中检测到，包括OB区的少突胶质细胞蛋白MTUS1以及CBM区的星形胶质细胞蛋白NFIA和NFIB。（图5B）

神经元细胞特征蛋白：

同样，大多数基于神经元mRNA的特征蛋白在所有脑区域中都检测到，包括神经元标志蛋白CD200、SYNJ2BP和SPTBN4，其余17%存在区域富集，包括CC区的MLIP和OB区的TPBGL。（图5C）

图5|不同细胞类型富集蛋白的蛋白丰度谱(图源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal.

脑细胞类型特征蛋白的区域分布：

脑细胞类型特征蛋白的区域分布：少突胶质细胞（O）的特征蛋白在皮质白质（CCw）区特别普遍，平均丰度比是其他区域平均值的1.3倍。白质主要由被少突胶质细胞包裹的神经元轴突组成。相比之下，神经元（N）特征蛋白在皮层（CC）区最为普遍，而大多数突触（Synapse）特征蛋白在CC区丰度较高，其次是HPC和CN。大脑皮层区前10种最富集的突触蛋白是SHISA6和SHISA7，以及参与脊柱结构的SYNPO和LRRC7。（图6）

图6|不同大脑区域突触蛋白的分析(图源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2

区域富集蛋白的细胞定位：

非区域富集的蛋白大多定位于细胞质或膜，而区域富集的蛋白多定位于细胞核，其次是膜、细胞质、跨膜和分泌。有趣的是，分泌和胞外基质相关蛋白在OB区高度表达。这些蛋白包括信号线索蛋白SBSPON、ARSF和ANXA2。核定位蛋白主要在小脑区（CBM）高度表达，包括溴结构域成员和锌指蛋白家族成员。CBM区的核蛋白高表达可能是由于小脑灰质中细胞核增大的高密度神经元所致。（图7）

图7|区域富集蛋白的细胞定位分析(图源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2

药物靶点的脑区表达差异：

将FDA批准的药物靶向的蛋白质列表与蛋白质组学数据相匹配，并确定了470种。其中，68种蛋白在大脑区域特异性富集。其中包括11个电压门控离子通道蛋白，以及ITGB3、ANXA2和HDAC2。值得注意的是HDAC2，它在小脑区显示出区域富集，同样，膜联蛋白家族成员ANXA2在皮质白质区（CCW）富集。此外，被归类为药物靶标的3个3类蛋白在特定区域分布，在基底神经节区ACE、DCC和CHAT高度表达，在中脑区ACE和DDC过度表达。（图8）

图8|药物靶点的脑区表达差异分析(图源：Tüshaus J., et al., The EMBO journal., 2

二、拜谱小结

该研究利用高通量蛋白质组学技术检测人类FFPE组织样本，这为分析人类生物样本库中数百万存档组织样本提供了巨大潜力；同时对13个脑区的分析揭示了独特的蛋白质组特征，识别了一些已知的特定脑区标志物和许多新候选物，发现mRNA与蛋白质水平存在显著差异，强调了直接测量蛋白水平的重要性。

对于FFPE样本及其不同区域的蛋白质组分析，拜谱生物对切片脱蜡、蛋白提取、肽段酶解、上机测试等全流程进行优化，并结合全新一代Astral质谱平台高稳定性、高灵敏度、高通量、高深度的优势，开启“超高深度FFPE蛋白质组”鉴定新纪元。拜谱生物已研发完成并建立了完善成熟的转录组学、蛋白组学、代谢组学以及多组学联合产品技术服务体系，助力发表高分文献，欢迎致电咨询！

参考文献：Tüshaus J, Sakhteman A, Lechner S, The M, Mucha E, Krisp C, Schlegel J, Delbridge C, Kuster B. A region-resolved proteomic map of the human brain enabled by high-throughput proteomics. EMBO J. 2023 Dec 1;42(23):e114665. doi: 10.15252/embj.2023114665.