背景

福尔马林固定和石蜡包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE）是临床组织保存的主要形式。据估计，全球有超过10亿个组织样本被保存在医院和生物样本库中，而其中大多数都是以FFPE形式储存的。对于某些类型的肿瘤组织，FFPE样品通常是唯一来源，这些样本可以为研究人员提供有关某些最罕见的癌症和其他疾病的重要信息。近年来，随着脱蜡技术的成熟和质谱仪器的发展，FFPE样本的科研价值得到充分开发，结合蛋白质组学技术的高分文献发表数量急速上涨。

因此，针对石蜡切片样本的特性，拜谱生物对切片脱蜡、蛋白提取、肽段酶解、上机测试等全流程进行优化，并结合全新一代Astral质谱平台高稳定性、高灵敏度、高通量、高深度的优势，在大队列样本中稳定实现8000+蛋白数量的检出，开启“超高深度FFPE蛋白质组”鉴定新纪元！

产品介绍

超高深度FFPE蛋白质组研究的主要步骤包括：FFPE切片脱蜡复水、蛋白质提取、肽段酶解、LC-MS/MS分析、数据库检索、数据分析和生信分析等。

图1 超高深度FFPE蛋白质组的技术路线

实测数据

拜谱生物采用主流脱蜡策略（二甲苯法），通过添加去垢剂和还原剂后沸水孵育超声，在高温条件下打断亚甲桥，来降低FFPE样本中甲醛交联带来的影响，从而增强FFPE样本蛋白质提取。并结合全新一代Astral革命性质谱平台进行质谱采集，对下机数据进行严格质控，得到的项目实测数据表明，大队列样本均稳定在8000以上的蛋白鉴定数量（图2）。另外，拜谱生物还提供特色生信分析和个性化定制分析，以全流程优质服务助力客户的项目研究。

图2 超高深度FFPE蛋白质组项目实测数据

应用案例

1.回顾性研究

应用案例：甲状腺乳头癌

文献名称：Risk stratification of papillary thyroid cancers using multidimensional machine learning

发表期刊：International Journal of Surgery，IF=15.3，2023年11月

技术方法：DIA蛋白组

样本类型：甲状腺乳头癌FFPE样本和FNA活检样本

研究内容：

甲状腺乳头癌（PTC）是最常见的内分泌恶性肿瘤之一，具有不同的风险水平。然而，PTC的术前风险评估仍然是全世界的一个挑战。研究者在2013-2020年收集了558名患者的肿瘤组织FFPE样本和活检FNA样本，样本分三组进行DIA蛋白组分析，共鉴定出5,774个与PTC相关的蛋白质，在这些蛋白中，有3种蛋白在模型中表现出显著的权重，成为评估PTC风险程度的关键定量指标，根据回顾性队列中274例FFPE样本的蛋白质组学数据和临床信息等多维特征，建立了一个包含17个变量的机器学习模型，有助于PTC术前风险评估，减少不必要的手术降低过度治疗。

图3 结合机器学习对PTC回顾性研究队列进行风险分层

2.疾病诊断分型

应用案例：乳腺癌

文献名称：Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes

发表期刊：Nature Communications，IF=16.6，2022年3月

技术方法：蛋白组学

样本类型：300例乳腺癌确诊患者的FFPE组织标本

研究内容：

乳腺癌是全球女性高发的一种恶性肿瘤，尽管乳腺癌的基因组分类取得了进展，但目前的临床测试和治疗决策通常基于蛋白质水平信息。因此，研究者对两个时间段乳腺癌诊断患者队列共300个FFPE手术标本进行了全面的蛋白质组学分析，发现在侵袭性PAM50分型的基底样(basal-like)病例中，存在两种生存期差异明显的亚型（2号亚型和3号亚型），Kaplan-Meier生存曲线和Forest多变量生存分析结果显示，这两种蛋白亚型在无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）上都有着明显的差异，其中3号亚型是四种蛋白亚型中预后结果最好的而2号亚型则是最差。研究者对88例三阴性乳腺癌病例的分析也证实了这种差异的存在，为临床上乳腺癌的精准分型与治疗提供依据。

图4 蛋白组学分析将乳腺癌分成3种疾病亚型（Karama A, et al., Nat Commun, 2022）

3.治疗靶点筛选

应用案例：胃肠道间质瘤

文献名称：Proteomic characterization identifies clinically relevant subgroups of gastrointestinal stromal tumors

发表期刊：Gastroenterology，IF=29.4，2023年11月

技术方法：蛋白组学、磷酸化蛋白组学

样本类型：193例未经治疗的胃肠道间质瘤FFPE样本

研究内容：

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的胃肠道间充质肿瘤，具有较高的转移率和复发率。研究人员对193例GIST患者进行了定量蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析。结果表明，不同位置或不同组织学级别的GIST其分子特征具有差异，在肿瘤中高表达的蛋白在剪接体和间隙连接中显著富集，在磷酸化蛋白质组中也有相同发现，而在癌旁中上调的蛋白在代谢相关通路中富集。对于癌旁的磷酸化蛋白质组，富集途径与观察到的蛋白质不同，是通过PKC和MAPK调节Rho蛋白信号转导，激活GTPase活性和胃泌素-CREB信号途径。MAPK7被鉴定并在功能上被证明与GIST中的肿瘤细胞增殖有关，SQSTM1表达增加会抑制患者对甲磺酸伊马替尼的反应。功能实验证实了SRSF3在促进肿瘤细胞增殖和导致预后不良中的作用。该研究识别不同位置胃肠道间质瘤的生物标志物，依据GIST肿瘤发病位置异质性来筛选精准治疗靶点。

图5 不同位置胃肠道间质瘤生物标志物特征（Sun MJ, et al., Gastroenterology, 2023）

4.多组学联合分析

应用案例：高级别成人弥漫性胶质瘤

文献名称：Proteomics separates adult-type diffuse high-grade gliomas in metabolic subgroups independent of 1p/19q codeletion and across IDH mutational status

发表期刊：Cell Reports Medicine，IF=14.3，2023年1月

技术方法：蛋白组学、磷酸化蛋白组学、全基因组甲基化和拷贝数变异（CNV）分析

样本类型：IDH野生型(IDHwt)胶质瘤、IDH突变型(IDHmut)胶质瘤以及非肿瘤对照组的共42个FFPE样本

研究内容：

高级别成人弥漫性胶质瘤是一种恶性神经上皮肿瘤，约占恶性原发性脑肿瘤的80%，WTO目前的分类是基于IDH1/2突变和1p/19q共缺失状态。胶质瘤蛋白质组研究有利于实现更好的患者分子分层和治疗靶点识别。研究者通过全基因组甲基化分析和拷贝数变异（CNV）分析对所有肿瘤（表观）遗传学进行了表征。应用FFPE蛋白质组学和磷酸化蛋白组学，共检测到5,724个蛋白质和5,212个高置信度磷酸位点。多组学分析表明IDHmut胶质瘤可以分为两种亚型，它们具有不同的能量代谢，总体上比1p/19q编码引起的差异更大。使用三个独立的胶质瘤蛋白质组数据集进行验证后，确认了这些亚组，并将IDHmut亚型与IDHwt胶质瘤中已建立的原神经和经典/间充质亚型联系起来，对IDHmut胶质瘤患者的治疗具有潜在的意义。

图6 FFPE多组学研究概述（Jakob MB, et al., Cell Rep Med, 2023）

送样建议

拜谱小结

石蜡切片作为医学中的常见样本，具有重要研究价值。针对石蜡切片样本的特性，拜谱生物推出全新超高深度FFPE蛋白质组产品，多次不同样本测试均可实现单针8000+的蛋白检出。高深度的蛋白检出可以充分利用罕见疾病或肿瘤等FFPE样本，实现大队列样本回顾性研究、疾病诊断分型、治疗靶点筛选、多组学联合分析等丰富的研究应用！

参考文献

[1] Li YH, Wu F, Ge WG, et al. Risk stratification of papillary thyroid cancers using multidimensional machine learning. Int J Surg. 2023 Nov. 37916932. doi: 10.1097/JS9.0000000000000814.

[2] Karama A, Gian LN, Sandra ES, et al. Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes. Nat Commun. 2022 Feb 16;13(1):896. doi: 10.1038/s41467-022-28524-0.

[3] Sun MJ, Tong YX, Yuan W, et al. Proteomic characterization identifies clinically relevant subgroups of gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 2023 Nov 21:S0016-5085(23)05509-9.

[4] Jakob MB, Nikolaus D, Martin M, et al. Proteomics separates adult-type diffuse high-grade gliomas in metabolic subgroups independent of 1p/19q codeletion and across IDH mutational status. Cell Rep Med. 2023 Jan 17;4(1):100877. doi: 10.1016/j.xcrm.2022.100877.