血清素（5-羟色胺）是一种单胺神经递质，可调节中枢神经系统和外周组织中的神经和其他的生物学功能。5-羟色胺不但可以通过直接促进肿瘤细胞的生长和侵袭改变肿瘤发展，还可以通过作用于浸润肿瘤微环境中的免疫细胞来发挥生物学功能。近年来的研究发现5-羟色胺可修饰到蛋白质的谷氨酰胺残基上，使蛋白质发生5-羟色胺化翻译后修饰，进而调节蛋白质的功能。然而，5-羟色胺介导CD8+T细胞抗肿瘤免疫的详细分子机制仍尚未被揭示。

2024年1月11日，上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所张志刚课题组和江苏大学附属医院肿瘤研究院王旭课题组在Molecular Cell（IF=16.0）上发表题为“A GAPDH serotonylation system couples CD8+T cell glycolytic metabolism to antitumor immunity”的研究文章。研究人员发现了一种甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的5-羟色胺化体系，可促进CD8+T细胞的糖酵解代谢和抗肿瘤免疫活性。该研究中拜谱生物为其提供LC-MS/MS质谱分析，鉴定出CD8+T细胞中的发生5-羟色胺化蛋白质以及确定GAPDH上发生5-羟色胺化位点，有助于揭示5-羟色胺化修饰增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫活性机制。

文章名称：A GAPDH serotonylation system couples CD8+T cell glycolytic metabolism to antitumor immunity（2024.01）

发表期刊：Molecular Cell

影响因子：16.0

拜谱提供技术：LC-MS/MS质谱分析

摘要图：

图1 摘要图(图源：Xu Wang et al., Mol Cell., 2024)

01、研究结果

研究人员首先通过评估发现5-羟色胺在生理条件下可能不参与免疫细胞的发育，随后在体外评估5-羟色胺对CD8+T细胞活化是否有直接影响，发现5-羟色胺可以直接促进αCD3/αCD28刺激的CD8+T细胞的增殖（图2A）。此外，细胞内染色显示干扰素(IFN)-γ因5-羟色胺而升高（图2B）。而RNA测序后的功能富集分析进一步证实5-羟色胺有效促进CD8+T细胞活化相关基因的表达（图2C）。研究人员使用丙炔化5-羟色胺类似物5-PT刺激CD8+T细胞，获得5-PT结合蛋白，即得到可能发生5-羟色胺化修饰的蛋白，进一步通过蛋白质谱进行分析，发现24小时和72小时分别鉴定出719和270种蛋白质，其中共同鉴定到182种蛋白（图2D和E）。共有蛋白富集热图显示确认为5-羟色胺化的蛋白质，包括肌动蛋白和组蛋白H3等（图2F）。此外，在5-PT免疫沉淀底物中鉴定到糖酵解相关蛋白（图2G）。通过测定前三种富集糖酵解相关酶的活性，发现5-羟色胺增强了GAPDH活性，但烯醇化酶1（ENO1）和乳酸脱氢酶A（LDHA）活性均未增强（图2H），表明5-羟色胺在促进GAPDH活性方面具有潜在作用。WB验证5-PT诱导β-肌动蛋白以及GAPDH的5-羟色胺化（图2I）。上述结果表明GAPDH是5-羟色胺化的底物，并且5-羟色胺化可能与活化的CD8+T细胞中糖酵解代谢的增强有关。

图2| 5-羟色胺促进 CD8+T细胞活化并诱导GAPDH 5-羟色胺化(图源：Xu Wang et al., Mol

研究人员随后通过一系列分析工作发现了组织转谷氨酰胺酶2（TGM2）介导的5-羟色胺化有助于CD8+T细胞活化和抗肿瘤免疫。为确定GAPDH上的5-羟色胺化位点进行了LC-MS/MS质谱分析，结果显示在合成的小鼠GAPDH肽中，46、76、183、202和262位的Gln残基可以被5-羟色胺化（图3A）。针对GAPDH蛋白的进一步分析显示Gln183和262是5-羟色胺化的反应性底物（图3B）。GAPDH的糖酵解活性与其亚细胞定位有关，GAPDH从细胞核到细胞质的转移决定了其有效的酶活性。GAPDH缺乏核定位信号（NLS），核外运信号（NES）的修饰对于GAPDH定位至关重要。GAPDH的NES在不同物种中高度保守（图3C）。LC-MS/MS质谱分析进一步证实GAPDH Gln 262ser（Q262ser）是TGM2诱导的5-羟色胺化的直接底物（图3D）。随后WB实验表明在CD8+T细胞中观察到较弱的GAPDH Q262ser修饰（图3E）。αCD3/αCD28刺激促进了GAPDH的5-羟色胺化翻译后修饰，5-羟色胺的添加进一步增强了这种修饰（图3E）。共聚焦显微镜成像还显示5-羟色胺化的GAPDH Q262ser在CD8+T细胞中几乎不表达（图3F）。流式分析结果显示在CD8+T细胞中检测到的GAPDH Q262ser不到3%（图3G）。αCD3/αCD28激活使GAPDH Q262ser增加到约28.4%。5-羟色胺进一步将GAPDH Q262ser的百分比提高到约40.8%（图3G）。总之，上述结果揭示了GAPDH Q262ser在活化的CD8+T细胞中的5-羟色胺化。

图3| Gln262 在 GAPDH NES 的5羟色胺化促进了其在CD8+T细胞中的细胞质定位和糖酵解活性(图源：Xu

随后研究人员发现5-羟色胺的细胞内积累对于增强CD8+T细胞活化和抗肿瘤免疫至关重要，而且5-羟色胺诱导的GAPDH 5-羟色胺化可以维持CD8+T细胞的长期活化。为了评估CD8+T细胞5-羟色胺化在肿瘤免疫治疗中的治疗潜力，研究了其在嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞抗肿瘤功效中的作用，发现在CAR-T细胞中过表达TPH1产生5-羟色胺可提高抗肿瘤疗效。

02、拜谱小结

作者完整的阐述了TGM2介导GAPDH Q262ser的5-羟色胺化翻译后修饰促进CD8+T细胞抗肿瘤活性的机制，GAPDH Q262ser自发性5-羟色胺化TPH1-CAR-T细胞具有强大的抗肿瘤活性。该研究结果通过提供受体非依赖性5-羟色胺化翻译后修饰的证据，扩大了已知的神经免疫相互作用模式的范围。这一过程中拜谱生物提供了LC-MS/MS质谱分析服务，助力化学蛋白质组学解析蛋白质功能及翻译后修饰相关的疾病机理。拜谱生物已研发完成并建立了完善成熟的蛋白组学、代谢组学以及多组学联合产品技术服务体系，欢迎致电咨询！

参考文献：Xu Wang, Sheng-Qiao Fu, Xiao Yuan, Feng Yu, Qian Ji, Hao-Wen Tang, Rong-Kun Li, Shan Huang, Pei-Qi Huang, Wei-Ting Qin, Hao Zuo, Chang Du, Lin-Li Yao, Hui Li, Jun Li, Dong-Xue Li, Yan Yang, Shu-Yu Xiao, Aziguli Tulamaiti, Xue-Feng Wang, Chun-Hua Dai, Xu Zhang, Shu-Heng Jiang, Li-Peng Hu, Xue-Li Zhang, Zhi-Gang Zhang. A GAPDH serotonylation system couples CD8+T cell glycolytic metabolism to antitumor immunity, Molecular Cell, 2024. doi.org/10.1016/j.molcel.2023.12.015.