文章标题: Metabolomics-based evidence of the hypoglycemic effect of Ge-Gen-Jiao-Tai-Wan in type 2 diabetic rats via UHPLC-QTOF/MS analysis

期刊: Journal of Ethnopharmacology

关键词：Ⅱ型糖尿病；代谢组学；中草药；疗效

研究背景：GGJTW是一种中草药，可以用于糖尿病的治疗，表明它有降低血糖的作用，但是其降血糖的机制任然不清楚

研究目的：探究GGJTW在Ⅱ型糖尿病中的作用机制

研究方法：UHPLC-QTOF/MS代谢组学分析高血糖症（高糖高脂肪饲料和链脲佐菌素）以及GGJTW的保护机制

实验设计：

实验结果

1.降血糖药的生理作用：

1）空腹血糖和体重变化：

如下图所示，相较于正常组，糖尿病组的空腹血糖水平(FBG)升高，说明造模成功（P < 0.01）。治疗组FBG水平从第2周开始下降，在第8周到达峰谷。起初，糖尿病组的体重是明显高于正常组的（P < 0.01）。到第8周，正常小鼠的体重持续增加，然而其他组别小鼠的体重一直处于下降状态。在第6周，M-GGJTW和模型组(P < 0.01)，H-GGJTW和模型组(P < 0.05)的体重有显著差异，在第8周，二甲双胍（降血糖药物）和模型组（P<0.05）、M-GGJTW/H-GGJTW和模型组的体重是有显著差异的。

2）生物化学参数

血清生学指标如甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总蛋白(TP)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(UA)。

ANOVA分析显示，模型组TG、TC、LDL-C浓度明显高于正常组(P < 0.01)。与模型组比较，不同剂量的GGJTW和二甲双胍均显著降低这三种脂质水平(P < 0.01)，M-GGJTW的作用尤为明显。但模型组HDL-C水平明显高于正常组(P = 0.01)。除L-GGJTW组较模型组略有降低外(P < 0.05)，各组间TP无明显差异。与正常组相比，模型组TBIL水平升高，但无显著性差异。与正常组和模型组相比，二甲双胍组和GGJTW组的TBIL水平明显升高。TBA水平的总体趋势与TBIL是一样的，治疗组和正常组以及治疗组和模型组相比，TBIL水平是显著升高的(P < 0.01)。与正常大鼠相比，所有糖尿病大鼠的ALT均明显升高(P < 0.01)，二甲双胍和GGJTW处理后ALT略有下降，但未恢复到正常水平。此外，与正常组相比，模型组和GGJTW组AST水平也有所提高。与此同时，糖尿病大鼠血清尿素氮(BUN)和尿酸(UA)均明显升高(P < 0.01)，用药后逐渐恢复到正常水平。所有组的CRE值基本相同，模型组的CRE值略低。

3）肝脏病变

肝组织HE染色代表性切片如下图所示。对糖尿病大鼠肝组织进行了病理组织学分析，发现大鼠肝组织存在严重的脂质积累。与正常肝细胞相比，肝细胞被明显增加的脂滴所充满。8周治疗后，二甲双胍阳性对照组和GGJTW组均有明显的肝损害减轻，肝细胞结构更加完整，脂滴积累明显减少。特别是M-GGJTW组肝细胞组织学表现出较好的修复改变，脂滴恢复到正常水平的趋势较其他组明显。肝脏形态学结果与之前BS和BL描述一致，说明GGJTW对肝脏具有保护作用。

(A) normal group,  (B) model group, (C) metformin group, and  (D) L-GGJTW group, (E) M-GGJTW group, (F) H-GGJTW group.

2.代谢组学分析

1）差异代谢物分析

用UHPLC-QTOF/MS对正常对照组、糖尿病模型组、M-GGJTW治疗组血清进行分析，PCA和OPLS-DA分析图如下图所示。正常组、糖尿病模型组和M-GGJTW组分离开来，各组别的血清代谢物在总体上是有明显差异的。

为了确定变量的贡献来区分两组，首先使用OPLS-DA模型中VIP值大于1.0的代谢物作为潜在生物标志物。影响模型的变量可以通过S-plot进行可视化(下图)。每个点代表一个变量，远离原点的点具有较高的P (corr)值，是潜在的判别变量。左下象限和右上象限的代谢物表示差异代谢物，用t检验进一步分析，突出显示P < 0.05的代谢物。

在正离子模式下，模型和正常组之间，M-GGJTW和模型组，M-GGJTW和正常组，只有22、37和17个代谢物是差异代谢物。在负离子模式下，得到32、22和27个差异代谢物。

正常组、糖尿病组和GGJTW处理大鼠的差异表达代谢物用热图呈现出来。在模型组vs 正常组中，ESI+/ESI-上调了17/15代谢物的表达，而ESI+/ESI-下调了5/17代谢物的表达。在M-GGJTW vs模型中，ESI+/ESI-表达上调28/15的代谢物，ESI+/ESI-表达下调9/7的代谢物。在M-GGJTW vs正常对照中，ESI+/ESI-的14/17代谢物表达上调，3/10表达下调。

代谢物的相对强度箱形图如下图所示，在TOF-MS ESI+模式下，与正常组相比，模型组的羟基丙酮、乙甾醇、去甾醇、GCDCA的积分水平分别升高21.94倍、11.50倍、11.48倍、10.39倍，居首位。口服M-GGJTW后，前三种代谢物的含量分别下降了90%、75%和83% (M-GGJTW/模型的FC值分别为0.10、0.25、0.17)。相比之下，GCDCA在M-GGJTW中升高(FC of M-GGJTW/Normal = 7.02)。模型组与正常组相比，GDCA、CA、GCA、LysoPC(18:1(9Z))、LysoPC(14:0)、l -苏氨酸、l -赖氨酸、d -甘露糖、氧化三甲胺水平显著上调(模型FC /正常> 2.82)，PC水平显著降低(模型FC /正常= 0.01)。GGJTW 与模型组相比，CA、GCA、CDCA、TCA、TDCA、TCDCA、牛磺酸、DG(18:0/20:4(5Z、8Z、11Z、14Z)/0:0)、LysoPC(14:0)、5-磷酸-D-核酮糖水平显著上调(FC of M-GGJTW/模型> 1.58)；LysoPE(16:0/0:0), LysoPC(18:1(9Z))、l -棕榈酰肉碱、棕榈酰乙醇酰胺、氧化三甲胺水平下降(M-GGJTW/模型的FC < 0.55)。GGJTW组与正常组相比，CA、GCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、LysoPC(14:0)和25-羟基维生素D3水平均显著上调(M-GGJTW FC /正常> 2.92)；PC(16:0/16:0)、异亮氨酸-酪氨酸、乙酰甘氨酸水平下降(M-GGJTW/Normal < 0.17)。

2）富集分析

为了进一步揭示GGJTW在代谢水平抗糖尿病作用的可能机制，运用MetPA和(KEGG, www.kegg.jp)在线数据库进行通路富集，探索最相关的代谢途径和功能。从整体上看，共影响14条代谢途径，确定了5个主要的影响代谢途径，原发性胆酸生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、甘油磷脂代谢和戊糖磷酸途径，其通路影响值分别为0.12、0.43、0.14、0.11和0.18。其中初级胆汁酸生物合成是富集水平最高的途径。六种代谢物(牛磺酸、钙、CDCA、TCA、GCA、TCDCA)受原代胆汁酸生物合成的影响。同时，牛磺酸和TCA也是牛磺酸代谢通路和次牛磺酸代谢通路的代谢产物节点。因此，这两条通路被确定为关键的靶代谢通路，这可能也是与GGJTW相关的最重要的代谢通路（如下图）。

颜色梯度和圆圈大小分别表示p值(黄色表示p值较高，红色表示p值较低)和路径影响(圆圈越大，影响越高)。影响高于0.10的路径进行标注。图中红色框为低p值、通路影响高的通路。

3）机制分析

GGJTW的疗效主要与原发性胆汁酸生物合成、牛磺酸及次牛磺酸代谢相关。M-GGJTW组与模型组相比，两种途径表达上调，用红色表示。用蓝色表示下调的代谢物，乙甾醇和去甾醇。

实验结论：

1）GGJTW-治疗组和模型组比较，有37代谢物为潜在的生物标志物，这些代谢物大多与胆汁酸代谢和脂质代谢相关，

2）GGJTW的糖尿病治疗机制中最主要的代谢路径是胆汁酸代谢路径，在这一路径中，胆酸（CA）、鹅去氧胆酸（CDCA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨胆酸（GCA）和牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）上调

文章思路总结：药物疗效机制分析→建立比较组（比较组，模型组，治疗组）→生理生化指标分析（判读建模是否成功和药物疗效）→差异代谢物分析（代谢组学分析）→代谢路径分析→治疗机制